Undang-undang Tubuh Kerajaan Johor telah memainkan peranan penting di kalangan masyarakat Melayu semasa menentang penubuhan Malayan Union. Faktor utama penentangan adalah kerana kesemua Sultan di Negeri-negeri Melayu akan hilang kuasa dan kedaulatan mereka terhadap negeri masing-masing, serta disebabkan cara Sir Harold MacMichael mengugut untuk mendapatkan tandatangan para Sultan.

Sultan Ibrahim dari Johor sendiri telah dipaksa oleh MacMichael untuk menandatangani perjanjian tersebut, membangkitkan kemarahan di kalangan masyarakat Melayu, sambil mendakwa bahawa menandatangani perjanjian tersebut adalah menyalahi Undang-undang Tubuh Negeri Johor yang tidak membenarkan Sultan Johor daripada melakukan apa-apa tindakan yang boleh menggugat kedaulatan negeri Johor. Sebagai maklum balas terhadap penentangan tersebut, baginda menganjurkan perhimpunan agung pertama UMNO di istana baginda di Johor Bahru pada Mei 1946. Beliau turut sama memboikot perlantikan gabenor pertama Malayan Union.

Hasil daripada kejayaan orang-orang Melayu menentang penubuhan Malayan Union, para pemimpin negeri-negeri Melayu yang lain turut menggunakan Undang-undang Tubuh Negeri Johor sebagai model bagi perlembagaan masing-masing bagi melindungi kedaulatan negeri-negeri Melayu dan kemudiannya digunapakai sebagai panduan dalam pembentukan Perlembagaan Persekutuan Tanah Melayu.